APLICABILIDADE DOS CONJUNTOS PARA DETECÇÃO DE RESÍDUOS
DE ANTIBIÓTICOS NO LEITE EM PROPRIEDADES LEITEIRAS
| C.H. Corassin & C.A.F. Oliveira |
| Departamento de Nutrição e Produção Animal,
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/Universidade de São Paulo, Av.
Duque de Caxias - Norte, 225, CEP 13630-000, Pirassununga, SP, Brasil.
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Este trabalho apresenta os principais critérios para a
utilização de conjuntos de reativos comercialmente disponíveis para a detecção
de resíduos de antibióticos no leite em propriedades rurais, particularmente no
produto individual de vacas leiteiras. O desempenho dos diferentes tipos de
conjuntos é analisado à luz das informações relativas às taxas de falso _
positivos e especificidade que apresentam em condições de campo. Considerações
são feitas sobre a relevância da análise de resíduos de antibióticos no leite
para assegurar a qualidade do produto destinado ao consumo humano.
PALAVRAS-CHAVE: Leite, antibióticos, resíduos, detecção.
APPLICABILITY OF ANTIBIOTIC RESIDUE SCREENING TESTS FOR MILK oN
DAIRY FARMS. This article presents the main principles for using commercially
available test systems for antibiotic residues in milk, particularly in
individual cows. Performance of different kits is analyzed in view of current
information regarding false-positive and specificity indexes. Considerations are
brought forth on the relevance of antibiotic residue tests for the quality
assurance of intended for human consumption milk products.
KEY WORDS: Milk, antibiotics, residues, detection.
A ocorrência de resíduos de antibióticos no leite tem sido
objeto de preocupação constante por parte das autoridades sanitárias, devido,
sobretudo, aos efeitos tóxicos destes compostos sobre a saúde humana, além da
possibilidade de favorecer o desenvolvimento de formas de resistência de
microrganismos patogênicos (World Health Organization, 1990). Por este motivo,
recomenda-se o monitoramento freqüente de resíduos de medicamentos e seus
derivados metabólicos no leite, adotando-se, como referência, os limites
estabelecidos através de agências internacionais (Boeckman & Carlson, 1997).
O controle de resíduos de agentes antimicrobianos no leite é
particularmente importante, também, para a indústria de produtos lácteos, devido
aos prejuízos causados pela interferência destes compostos no desenvolvimento
das culturas lácteas largamente empregadas em fábricas de laticínios (Spreer,
1991).
Neste contexto, a produção intensiva de leite de alta
qualidade, e sem resíduos de antibióticos, reveste-se de extrema importância
para os produtores, ao se considerar os prejuízos e as penalidades decorrentes
da rejeição do leite contaminado com valores acima dos níveis de tolerância.
Considerando a elevada prevalência de mastites e outras enfermidades que
acarretam o uso de drogas antimicrobianas em vacas leiteiras, em nossas
condições, torna-se necessário disponibilizar aos produtores instrumentos
eficazes que permitam assegurar a produção de leite isento de resíduos de
antibióticos.
No presente trabalho, são apresentados os critérios para a
utilização dos principais conjuntos comercialmente disponíveis para a detecção
de resíduos de antibióticos no leite individual de vacas leiteiras.
Características dos conjuntos analíticos para detecção
de antibióticos
Nas últimas décadas, foram desenvolvidas diversas metodologias
analíticas para a detecção rápida de resíduos de drogas antimicrobianas no
leite. Estas técnicas encontram-se disponíveis no mercado sob a forma de
conjuntos de reativos prontos para uso em condições de campo. Os conjuntos foram
inicialmente desenvolvidos para utilização em plataformas de recebimento de
leite nas usinas, porém, têm sido aplicados, também, em propriedades rurais,
para verificar a presença de resíduos no leite armazenado nos tanques ou
proveniente de vacas mantidas sob tratamento com antibióticos (Andrew, 1997).
Os conjuntos mais antigos apresentam, como princípio, a
inibição do crescimento de espécies de bactérias sensíveis, o que possibilita a
sua aplicação em diferentes tipos de amostras, como urina, soro e vários
tecidos. A análise é executada em placas, utilizando-se um disco ou swab
estéril posto em contato com o fluido ou tecido suspeito de conter resíduos. O
swab é, então, posicionado na placa de ágar contendo a bactéria sensível
ao antibiótico, após o que é incubado por 8 a 12 horas, dependendo do conjunto
utilizado. A zona de inibição de crescimento bacteriano circundante ao
swab indica a presença de antibiótico na amostra. Na atualidade, estes
conjuntos são utilizados, principalmente, para a detecção de resíduos de drogas
antimicrobianas em carcaças de animais de abate (Cullor, 1992).
A inibição do crescimento microbiano pode ser avaliada, também,
através de indicadores colorimétricos. Os sistemas que empregam esta técnica são
conhecidos pela sigla BsDA (Bacillus stearothermophilus Disk
Assay), considerados oficiais para a detecção de resíduos de antibióticos
b-lactâmicos no leite (Katz & Siewierski, 1995). Diferentemente dos testes
de placa, a inibição microbiana é constatada usando-se um indicador de pH, cuja
cor é alterada na presença de compostos ácidos produzidos pelo B.
stearothermophilus. Deste modo, se a amostra contém resíduos, o
crescimento bacteriano é inibido e a mudança de cor não ocorre.
Os métodos que empregam princípios microbiológicos, contudo,
apresentam certas desvantagens, pois necessitam equipamentos e conhecimento
técnico especializado para sua execução; além disso, os resultados não são
imediatos, somente drogas antibacterianas são detectáveis e a interferência de
outras substâncias pode provocar resultados falso-positivos (Andrew et
al., 1997).
Recentemente, novos métodos analíticos, baseados em reações
imunológicas e/ou enzimáticas foram aprimorados, oferecendo uma alternativa
prática aos sistemas microbiológicos. Entre as vantagens destas técnicas,
destacam-se rapidez e simplicidade de execução, menor conhecimento técnico
exigido para suas operações, maior especificidade para determinados antibióticos
e possibilidade de detecção de outros agentes antimicrobianos, além de
antibióticos. Os conjuntos que empregam princípios imunológicos baseiam-se na
competição por sítios de ligação em receptores de células bacterianas que são
específicos para várias classes de antibióticos. Os receptores bacterianos são
adicionados à amostra de leite, juntamente com antibióticos conjugados com
isótopos radioativos (radioimunoensaio) ou enzimas (ELISA). A concentração de
resíduos na amostra pode ser avaliada através de radiometria ou colorimetria,
sendo diretamente proporcional ao número de sítios receptores ocupados pelo
antibiótico não marcado (Seymour et al., 1988).
Vantagens da aplicação do teste individual em vacas
leiteiras
A abordagem tradicional de controle de resíduos de antibióticos
no leite preconiza a análise de amostras colhidas nas plataformas das usinas ou
no tanque de armazenagem de leite nas propriedades rurais. Existem, no entanto,
diversas vantagens em analisar individualmente o leite de vacas que foram
tratadas com antibióticos, porém as principais estão relacionadas aos aspectos
econômicos e de qualidade do leite produzido. O primeiro é justificado pelo fato
de que, se a análise do tanque for positiva para resíduos, o impacto financeiro
será muito maior que o decorrente de um resultado positivo para uma vaca. A
qualidade do leite produzido, por outro lado, também é assegurada, pois o teste
individual das vacas previne a contaminação de todo o produto ordenhado e
recolhido no tanque. É importante lembrar que a adição de leite contendo
antibióticos, ao leite não contaminado, nem sempre consegue diluir os resíduos
no leite de mistura até os níveis de tolerância.
Os testes seletivos são instrumentos auxiliares de grande
valia, pois permitem monitorar o intervalo de carência após a aplicação de
antibióticos, assegurando que níveis residuais no leite de vacas tratadas sejam
menores que os tolerados, antes da adição ao tanque (Andrew, 1997; Corlett,
1997). Porém, alguns cuidados devem ser observados:
Fatores que podem causar resultados falso-positivos
Diversos trabalhos indicam que os produtores de leite que se
utilizam de testes seletivos para a avaliação de antibióticos no leite possuem
menor incidência do produto contendo resíduos (Andrew et al., 1997;
Bishop et al., 1985). Deve-se ressaltar, contudo, que o desempenho dos
conjuntos pode variar amplamente quando utilizado no leite de diferentes
animais, afetando, principalmente, a capacidade do teste em detectar resíduos em
amostras comprovadamente positivas. Com relação aos antibióticos ß-lactâmicos,
alguns trabalhos demonstram que a especificidade é menor quando realizado no
leite de animais acometidos de mastite clínica (Cullor, 1992; Van Eenennaam
et al., 1993).
A ocorrência de resultados falso-positivos indica a presença de
altos níveis de antibióticos no leite de vacas não tratadas, ou que contém
resíduos em concentrações abaixo dos níveis de tolerância. As conseqüências
deste problema recaem principalmente sobre o produtor, acarretando perdas
econômicas consideráveis devido ao descarte indevido de leite.
Resultados falso-positivos, cujos valores variaram de 0 a 83%,
foram reportados para diversos testes ß-lactâmicos, quando estes foram usados
individualmente em vacas (Andrew et al., 1997; Bishop et al.,
1985; Seymour et al., 1988; Van Eenennaam et al., 1993).
A contagem de células somáticas (CCS) aumenta no leite durante
a infecção intramamária, acompanhada de uma rápida elevação de componentes do
plasma, devido à resposta inflamatória (Spreer, 1991). Estes componentes
mantém-se em níveis elevados mesmo após o tratamento e, dependendo do principio
analítico do teste, poderão interferir no resultado do teste (Carlsson et
al., 1989). Os efeitos da CCS sobre a ocorrência de falsos-positivos não são
ainda conclusivos, embora alguns estudos indiquem maior proporção deste tipo de
resultado no leite com CCS acima de 2.500.000/mL, conforme evidenciado na Tabela 1.
Os percentuais de gordura e proteína do leite também podem
variar amplamente de um animal para outro, assim como entre raças, estágios de
lactação e condições da infecção intramamária (Sischo & Burns, 1993). As
variações destes constituintes influenciam significativamente os resultados dos
testes de resíduos, quando utilizados individualmente em vacas. Andrew et
al.(1997) obtiveram um aumento na probabilidade de falsos-positivos
possivelmente relacionado com o aumento na gordura e/ou proteína do leite.
A amostragem do leite também constitui fator relevante para uma
boa realização do teste. Recomenda-se desprezar os primeiros jatos de leite, uma
vez que estes são geralmente ricos em CCS, em comparação à composição total do
leite produzido pela vaca e, conseqüentemente, podem acarretar uma maior
proporção de falsos-positivos em relação ao leite de mistura (Cullor, 1992; Van
Eenennaam et al., 1993).
É importante ressaltar que os conjuntos de reativos necessitam
de condições adequadas de armazenagem e execução, pois, como material biológico,
são sensíveis às variações do ambiente. Assim, deve-se procurar mantê-los em
temperatura conveniente para conservação, bem como realizar o teste em sala
apropriada para esta finalidade, evitando a ocorrência de resultados
falso-positivos. Além disso, as orientações fornecidas pelo fabricante devem ser
seguidas rigorosamente, principalmente no que se refere à alíquota de leite
tomada para o ensaio, ao uso adequado dos reagentes e cumprimento dos períodos
de incubação, quando necessários.
Recomendações para o uso dos conjuntos em propriedades
rurais
A implementação de um programa efetivo de controle de mastites
constitui a principal forma de reduzir o uso de antibióticos nos animais e,
conseqüentemente, o risco de ocorrência de resíduos no leite. Deste modo, os
programas devem contemplar, necessariamente, o monitoramento de resíduos através
da utilização de sistemas analíticos apropriados, considerando-se os seguintes
critérios:
A adoção dos procedimentos acima pode, de fato, reduzir as
perdas econômicas decorrentes de resultados falso-positivos. Isto é
particularmente importante para os produtores, tendo em vista a entrada em
vigor, a partir de janeiro/2000, de legislação concernente aos critérios de
qualidade do leite recebido pelas usinas, que deverão incluir limites de
tolerância para resíduos de antibióticos ß-lactâmicos. Contudo, a interpretação
dos resultados destes conjuntos deve ser cuidadosa, devido à sua natureza
qualitativa. Pesquisas são necessárias para o desenvolvimento de conjuntos mais
específicos e com sensibilidade adequada aos limites de tolerância para os
diversos tipos de antibióticos empregados na produção leiteira.
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Recebido para publicação em 21/6/99
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